ФАРМАЦЕВТИЧНИ СРЕДСТВА

[ROCK]

ВИТАМИНИ

Досега са известни 13 витамина. Като химични съединения те са толкова различни помежду си, че за тях може да се каже само, че нямат нищо общо с основните хранителни вещества (т.е. не са нито мазнини, въглехидрати или аминокиселини или белтъци), както и това, че могат да се разделят на две групи: силно неполярни и полярни. Това деление е не само една историческа традиция, а отразява съществени различия в обмяната на витамините.

Така мастно разтворимите витамини (А, В, Е и К) се реабсорбират заедно с липидите, за което е необходимо действието на панкреатичните липази и наличието на жлъчни соли. Смущения в тази реабсорбция могат да доведат до възникването на едновременен витаминен дефицит по отнощение на А, В, Е и К. От друга страна, веднъж резорбирани, тези витамини могат да образуват известен резерв в черния дроб, който пък е гаранция срещу кратковременни нарушения в снабдяването. Но тъкмо по тази причина (т.е. поради тяхната неполярност) организмът има проблеми при справяне с излишъка от тях, което пък може да доведе до прояви на токсичност, т.е. до хипервитаминоза.

Водно разтворимите витамини като достатъчно полярни лесно се изхвърлят с урината, ако са в излишък. Това означава, че тук по-трудно може да се наблюдават проявите на токсичност, но пък много по-леко се стига до хипо- или авитаминоза, тъй като организмът не е в състояние да създаде каквито и да е резерви.

Голяма част от витамините бяха открити при наблюдение върху болни от съответната авитаминоза. За да се приеме дадено вещество за витамин, трябва да се установи:

а) че то е задължителна съставка на храната;

б) че болните повече или по-малко продължително време не са

консумирали обичайната смесена диета;

в) че вкарването на това вещество в организма и то в много малки в

сравнение с храната количества води до излекуване на авитаминозата.

Тази схема ни показва ясно пътя на възникването и развитието на нашите представи за витамините, но тя не е приложима във всички случаи. Това е така, защото може да има други причини, водещи до авитаминоза, независимо от наличието на даден витамин в храната. Вече се спомена, че нарушенията в смилането и резорбцията на липидите може да доведе до едновременен дефицит на витамините А, В, Е и К. При намалена синтеза и секреция на т.н. вътрешен фактор се стига до злокачествена анемия вследствие нарушената резорбция на витамин В12, а при консумация на суров яйчен белтък по същата причина се стига бързо до биотинов дефицит.

При някои мутации в ДНК, водещи до вродени енмзимни дефекти, ста¬ва невъзможно химичното превръщане на витамина, получен от храната, в неговата биологично активна вътреклетъчна форма. Така нар. се появява т.нар. витамин Б-резистентен рахит.

Приемането на лекарствени средства също може да предизвика ави¬таминоза. Така малко разтворимите сулфамиди и антибиотици, престояващи по-дълго в чревния тракт, потискат растежа на чревната флора, която е главният доставчик на витамин К, а и други витамини за организма. Лечението на туберкулозата с изониазид има за следствие рязкото намаление на наличния пиридоксал. Лечението с цитостатици (напр. аметоптерин) цели да се намали участието на фолиевата киселина в обмяната на туморните клетки посредством прекратяване на активирането й до тетрахидрофолати.

При оценка на дневните нужди на организма от витамини се изпол¬зват различни критерии. Минимални нужди — това е дневно поеманото

количество витамин, което предотвратява появата на съответната авита¬миноза. Оптималните нужди представляват по-голямо количество, което осигурява организма при емоционално, физическо и метаболитно нато¬варване, и то с известни резерви. Определянето на оптималните нужди и като използвана методика, и като критерии често поражда спорове между изследователите, но все пак натрупаният значителен опит в това отноше¬ние намалява несигурността. Накрая още по-голяма е т.н. лечебна доза при редица авитаминози, както и при други заболявания. Във връзка с казаното по-горе трябва да се изтъкне, че в редица случаи наистина е трудно да се определят с точност дневните нужди от някои витамини. Това важи напр. за витамин К (който постъпва не толкова от храната, колкото от чревната флора); за витамин Б (който може да се изработва в кожата при наличие на слънчево сгряване); за никотинамида (част от който може да се синтезира в организма от аминокиселината триптофан) и др.

Накрая следва да се изтъкне, че нуждите на организма от витамини са променлива величина. Така при бременност, кърмене, при стари хора, при тежка физическа работа и при някои болестни състояния може лесно да се изпадне в състояние на хиповитаминоза, ако не се увеличи постъп¬ването на определени витамини. Трябва да се помни още, че начинът на хранене също е от значение: консумацията предимно на въглехидрати изисква по-голям внос на тиамин, на белтъци — повече пиридоксин, но по-малко никотинамид, а на масти — повече токоферол (особено ако мастите съдържат повече ненаситени мастни киселини). Кулинарната обработка води до деструкция на редица витамини, с което трябва задължително да се съобразяваме при определяне на дневните нужди. Разбира се, трябва да се помни също, че витамините имат мощен ефект в нищожно малки количества.

Има все още някои неизяснени моменти в нашето разбиране за механизма на действието на витамините, въпреки че тук са постигнати

з

забележителни успехи. Така ние вече знаем, че голямата част от витами¬ните са или коензими, или важна съставка на коензимите. Последните участват в редица ензимни реакции, които изглеждат почти изчерпателно проучени, което пък хвърля светлина върху биохимичната функция на витамините. Ние познаваме с подробности и биохимичната функция на витамин А в процеса на превръщане на светлинната енергия в химична, а след това и в нервен импулс. Същото е и за функцията на никотинамида, като част от двата коензима (НАД+ и НАДФ+) на анаеробните дехидрогенази. Но това, за съжаление, не ни помага да разберем защо и как се появява кератомалацията при авитаминоза А, или пък пелаграта при ниацинов дефицит. При други витамини проявите на съответния дефицит изглеждат поне засега още по-трудни за разбиране.

[ROCK]

ВОДНОРАЗТВОРИМИ ВИТАМИНИ

Витамин В (тиамин, аневрин)

Витамин В е съединение, съдържащо пиримидинов и тиазолов пръстен, свързани помежду си с метиленов мост. Освен това в молекулата на тиамина се съдържат хидроксилна група и аминогрупа. Той представлява бяло кристално вещество, устойчиво при загряване в силно кисела среда (рН-3,0). При загряване в неутрална или алкална среда витамин В] се разпада бързо на съставните си части.

Под действието на окислители тиаминът се окислява в алкална среда до тиохром, който флуоресцира. Реакцията е позната под названието тиохромна реакция. Степента на флуоресценцията е право пропорционална на количеството на витамин В1 поради което тиохромната реакция се използува често за и количествено определяне на витамин В1. Внесеният с растителната храна тиамин се превръща в тъканите на животинските организми в пирофосфатен естер тиаминпирофосфат.

Тиаминпирофосфатът участвува като коензим в състава на ензими или ензимни системи, катализиращи реакциите на неокислително или окислително декарбоксилиране на а-кетокисели (пируват и а -кетоглутарат), и реакции на пренос на С2-фрагмент „активен гликолалдехид" (при пентозофосфатния цикъл). Най-активна в молекулата на тиамина е неговата тиазолова част. Азотът на тиазоловото ядро има способността да образува четвъртични амониеви соли.

При недостатък на тиамин се затруднява по-нататъшното превръщане на пируваха и той се натрупва в излишни количества в тъканите. Нервната тъкан е особено чувствителна към натрупване на повишени количества от пируват в нея. Денонощната потребност на организма на човека от тиамин е 2-—З мг. При повишаване на количеството на въглехидратите в храната се увеличава и нуждата от тиамин.

Тиохромна реакция за доказване на тиамин

П р и в ц и и

В алкална среда под действие на калиев ферицианид тиаминът се окислява до тиохром, който флуоресцира интензивно синьо. В реакцията участвува тиазоловата част от молекулата на тиамина.

Реактиви:

1. 5% разтвор от калиев ферицианид;

2. 30% разтвор от натриева основа;

3. Изобутилов алкохол;

4. Тиамин на прах.

Начин на р а б о т а

В малък обем вода се разтваря малко количество тиамин на върха на ладийка, — прибавят се 5 капки 5% разтвор К3Ре(СN)б и 5 капки 30% разтвор на натриева основа. Съдържимото се размесва добре. Добавят се 15 капки изобутилов алкохол. Разклаща се енергично. След кратко

престояване се отделят двата слоя. Горният (алкохолен) слой се пренася с помощта на капиляра или микропипета в суха епруветка. Той съдържа получения при реакцията тиохром. Последният се доказва по синята флуоресценция, която може да се наблюдава в ултравиолетова светлина. Витамини В2 (рибофлавин, лактофлавин)

Витамин В2 спада към флавините, вещества с жълтозелен цвят, чиито разтвори флуоресцират. Нарича се рибофлавин, понеже съдържа алкохола рибитол, свързан с метилиран изоалоксазинов пръстен. Представлява 6,7-диметил-9-рибитил-изоалоксазин.

Рибофлавинът е жълто кристално вещество, разтворимо във вода и етилов алкохол. Разтворите на рибофлавина имат рязко изразена жълтозелена флуоресценция, най-добре отчетлива в слабо кисела и неутрална среда. Устойчив е на нагряване (при 120°С в течение на няколко часа не се разрушава биологичната му активност). Под действието на ултравиолетови лъчи се превръща в разпадни продукти (в основна среда — лумифлавин, в кисела — лумихром), които не притежават витаминно действие. Дневната потребност от витамин В2 е 2—3 мг.

Производни на рибофлавина (витамин В2) са двата флавинови коензими: флавинмононуклеотид (ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФА). Свързани със специфични белтъци, тези коензим образуват флавопротеинови ензими или флавинензими, вземащи участие в процесите на биологичното окисление като преносители на протони и електрони.

Биологичното действие на флавинензимите е свързано с наличието на двойни връзки в хетеропръстенната система на изоалоксазина, основното ядро в молекулата им, което действува като обратима редоксисистема. Окислената форма флуоресцира за разлика от редуцираната.

Реакция за доказване на витамин В2

П р и н ц и п

Витамин В2 се редуцира лесно, като при това загубва свойственият си жълт цвят и се превръща в безцветно левкосъединение. Този процес е обратим, като обратното протичане на реакцията може да се осъществи чрез въздействие на молекулен кислород върху левкосъединението.

Реактиви:

1. 0,025% разтвор от рибофлавин;

2. Концентрирана солна киселина;

3. Цинк на гранули.

'Начин на р а б о т а

В епруветка се поставят 10 капки 0,025% воден разтвор на рибофлавин, прибавят се 5 капки концентрирана солна киселина и малко парче цинк. Отделящият се водород редуцира рибофлавина чрез образуването на междинно съединение с червен цвят (родофлавин) и накрая безцветен левкофлавин. При реакцията разтворът изменя цвета си от жълт в червен, след което се обезцветява. При престояване в горния слой на течността се появява жълто оцветяване поради окислението на левкофлавина от атмосферния кислород в рибофлавин.

Витамин Вб (пиридоксин)

Витамин В6 (2-метил-3-хидрокси-4,5-дихидроксиметилпиридин) е безцветно кристално вещество, добре разтворимо във вода и алкохол. Производните на пиридоксина са пиридоксал фосфат и пиридоксаминфосфат, които представляват коензими на различни ензими, участвуващи в обмяната на аминокиселини (трансаминази, декарбоксилази на аминокиселини, кинуренинаминотрансфераза в обмяната на триптофан и др.).

Реакция за доказване на витамин В6 Принцип

Витамин Вб образува с РеС1з комплексно съединение от типа н железен фенолат, имащо червен цвят.

Реа ктиви:

1.5% разтвор от витамин В6

5% разтвор от ферихлорид. Начин на работа

Към 5 капки 5% воден разтвор на витамин Вб, се прибавя 1 капка5 % разтвор от РеС13. Съдържимото се размесва добре. Течността придобива червен цвят. (Червено оцветяване се получава също при взаимодействиетс на РеС1зС разтвор на пирогалол).

Витамин С

Антискорбутният витамин С (L-аскорбинова киселина) е близък пс строежа си с простите въглехидрати. Последните представляват изходния! материал, от който растенията синтезират витамин С. По своя химичен състав L-аскорбиновата киселина е y-лактон на 2,3-диенол-гулоновата киселина (ненаситена хексонова киселина).

Като отдава два водородни атома, L-аскорбиновата киселина се окислява в дехидроаскорбинова киселина. Тази реакция е обратима: дехидроаскорбиновата киселина, присъединявайки два водородни атома, лесно се редуцира в Ь-аскорбинова киселина. Тези водородни атоми дехидроаскорбиновата киселина може да получи от редуцираната форма на коензима на дехидрогеназите (който ги е отнел от различни окисляеми субстрати). По този начин редокси-системата: L-аскорбинова киселина — дехидроаскорбинова киселина взема участие в транспорта на водород (електрони и протони), т. е. в реакциите на оксидоредукция на някои продукти от обмяната на веществата. Важна роля в тези реакции играе свободният радикал на монодехидроаскорбиновата киселина - продукт на

отцепване не на два, а на един електрон от аскорбиновата киселина Окислението на аскорбиновата киселина се каталнзира в растенията 01 специфичен ензим, съдържащ мед, наречен аскорбатоксидаза (ЕС 1.10.3.3), Важна роля в окислението на витамин С в животинския организъм, къдетс липсва аскорбатоксидазата, играе медсъдържащият белтък (церулоплазмин, ферооксидаза; ЕС 1.16.3.1). Дехидроаскорбиновата киселина е твърде неустойчиво съединение. Ако условията на средата благоприятстват протичането на редукция (кисела. среда), дехидроаскорбиновата киселина се превръща, обратно в Ь-аскорбинова киселина. В неутрална и особено в алкална среда, както и в присъствието на медни соли дехидроаскорбиновата киселина се подлага на необратимо разпадане, като се окислява в продукти, които вече не се превръщат в L-аскорбинова киселина.

Въпреки че за L-аскорбиновата киселина не е открита коензимна функция, несъмнено е важното й значение за нормалното протичане на множество биохимични процеси. В основата на нейната функция в организма на първо място лежат тези особености в строежа й, благодарение на които тя образува окислително-редукционна система, способна да участвува в транспорта на електрони в някои биохимични реакции (превръщане на пролин в оксипролин, необходим за синтезата на колагена — най важния белтък на съединителната тъкан, някои реакции в обмяната на триптофана, образуване на стероидни хормони и др.

Поради наличието на асиметричен въглероден атом в молекулата са възможни L - и D-форми на двете киселини. Биологично активни са само L-аскорбинова и L-дехидроаскорбиноза киселина. Те са активни компоненти на процесите на преноса електрони.

Необходимата дневна доза от витамин С е 70—120 мг (по-високи стойности са необходими за бременни и кърмещи жени), т, е. значително по-голяма от тази за други витамини. Основен източник 'за витамин С е

растителната храна.

Качествени реакции за доказване на витамин С (L -аскорбинова

киселина)

Реакциите за L-аскорбинова киселина се основават на способността й да се окислява лесно и да редуцира редица съединения; 2,6-дихлорфенолиндофенол, метиленово синьо, ферихлорид, сребърен нитрат. Първите две съединения се обезцветяват при редукцията си, а редуцирането на FеСl3 до FеС12 може да се открие лесно по реакцията с калиев ферицианид.

Редукция на калиев ферицианид с витамин С

П р и н ц и п

Витамин С редуцира калиев ферицианид (в алкална среда до калиев фероцианид, който с йони на тривалентно желязо образува в кисела среда берлинско синило.

Реактиви:

1. 10% разтвор от натриева основа;

•

2. 10% разтвор от солна киселина;

3. 5% разтвор от калиев ферицианид;

4. 1% разтвор от калиев ферицианид;

5 Приготвят се водни екстракти, съдържащи L-аскорбинова киселина, от картофи и шипки чрез стриване в порцеланов хаван на изследвания материал с трикратен обем дестилирана вода.

Начин на раб о та

В две епруветки се поставят по 5 капки водни екстракти на витамин С от картофи и шипки, а трета — 5 капки дестилирана вода, Към трите епруветки се добавят по една капка 10% разтвор от NаОН и 1 капка 5% разтвор на КзFе(СN)б- Сместа в гоите епруветки се разбърква. След това се прибавят по три, капки 10 % разтвор на ИС1 и една капка 1% разтвор от

ферихлорид. Разбърква се добре. В епруветките с екстрактите на витамин С се получава интензивно синьо оцветяване от берлинско синило. В контролната епруветка с вода не се получава синьо оцветяване.

Количествено определяне на витамин С. (L-аскорбинова киселина)

Принцип

Определянето се извършва чрез титруване на изследвания подкиселен разтвор (в условия, предпазващи витамин С от разрушаване) с 0,1 N разтвор на КJO3. КLO3 окислява J в солнокисела среда до елементарен йод. Отделеният йод окислят, аскорбиновата киселина, в резултат на коетo тя преминава в дехидро форма,

Определяне съдържанието на витамин С в сухи шипки

Р е а к т и.в и:

1,2% солна киселина;

2.1% KJ

3.0,1,N КJO3

Начин на р а б о т а

На рогови везни се претеглят 5 г сухи шипки и се стриват добре в малък порцеланов хаван с 10.мл дестилирана вода и 0.1 г. стъклен пясък. Съдържимото се пренася количествено с вода (внимателно, по стъклена пръчка през фуния) в мерителна колба от 100 мл, Обемът на течността в колбата се довежда до белега, колбата се затваря със запушалка, СЪДЪРЖИМОТО се разбърка няколко пъти и се филтрува презкнижен филтър.

Към 10 ml от приготвения разтвор се прибавят 0.5 ml 1% разтвор на КJ, 2 ml разтвор на нишесте и 1 ml 2% разтвор на солна киселина и се титрува с 0,1 N разтвор на КJО3 до поява на трайно кафяво оцветяване.

Един милилитър 0,1 N разтвор на КJО3 отговарят на 0.008806 г.

Аскорбинова киселина

[ROCK]

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА АКТИВНОСТТА НА ЧИСТИ ПРЕПАРАТИ ОТ АНТИБИОТИЦИ

Активността на антибиотиците се изразява в Е/мл или в Е/мг. При киселинна хидролиза на тетрациклините или при алкална хидролиза на стрептомицина се получават разпадни продукти, които са цветни и дават възможност за фотометриране. Интензитетът на оцветяването е пропорционален на концентрацията на антибиотика.

При алкална хидролиза на пеницилина се получава пеницилинова кесилина, която е безцветна и биологично неактивна и затова определянето на концентрацията му не може да стане фотоколориметрично.

За определяне на активността на пеницилина се прилага йодометричния метод. В зависимост от количеството на пеницилина при неговата хидролиза се свързва повече или по-малко йод, а излишъкът се титрува с натриев тиосулфат

Йодометричо определяне активността на пеницилин

(по АНсто и Мипдell

Ход на работа

Вземат се две йодни колби (за контрола и проба) и в двете се поставят по 5 мл. от филтрувания нативен разтвор на пеницилин.

В работната колба се прибавя 1 мл. 1н NаОН и се оставя да престои 20 мин. След това се прибавят 1мл. 1н НС1, 5 мл ацетатен буфер с рН 4,5 и 20 мл 0,01 н р-р на йод. Престоява още 20 мин. на тъмно, след което се титрува с 0,01 н р-р на натриев тиосулфат.

В контролната колба се прибавят 5 мл. ацетатен буфер и 20 мл 0,01 н р-р на йод. Престоява 20 мин. на тъмно, след което се титрува с 0,01 н р-р на натриев тиосулфат.

Проба:

5мл. р-р на пеницилин

5 мл. 1н NаОН и престоява 20 мин.

1мл. 1нНС1

5 мл ацетатен буфер с рН 4,5

20 мл 0,01 н р-р на йод

Престоява 20 мин. на тъмно, а излишъкът се титрува с 0,01 н р-р на натриев тиосулфат. За индикатор служи 1% р-р на разтворима скорбяла.

Контрола;

5мл. р-р на пеницилин 5 мл ацетатен буфер с рН 4,5

20 мл 0,01 н р-р на йод N престоява 20 мин. На тъмно, след което се титрува както пробата.

Активността на пеницилина се изчислява по следната формула:

V . К. 1,670

Е/мл = ;

2,25.5

К. 1,670

= С =148,4

2,25 .5

По опростено единиците на пеницилина в мл. ( Е/мл) се изчисляват като 148,4 се. умножи с разликата в количеството на натриевия тиосулфат, изразходвани за титруване на контролата и пробата: 148,4 Х V

V N разликата в обемите на Nа2S2О3, изразходвани за титруване на контролата и пробата;

К N коефициент за 0,01 н р-р на Nа282О3;

1,670 N международни единици на пеницилина;

5 N количеството на взетия разтвор на пеницилина;

2,25 N количеството в мл. на 0,01 н р-р на йод, свързващо се с 1мг. кристален пеницилин.

Фотоколориметрично определяне активността на стрептомицина (малтолен метод)

При нагряване на стрептомицина с натриева основа се образува малтол, който при реакция с РеС12 дава пурпурночервено оцветяване.

Ход на работа

Вземат се две мерителни колбички с обем 25 мл., от които едната е за проба, а другата N за контрола.

Работна колба:

10 мл. р-р на антибиотик

2мл. 1н NаОН N кипи си 10 мин. и се охлажда на водна струя

2мл. 1,2нНС1

5 мл. 0,25 % р-р на РеС12

дест. Н2О до марката на мерителната колба

Контролна колба:

10 мл. дест. Н2О

2мл. 1н NаОН N кипи си 10 мин. и се охлажда

2мл. 1,2нНС1

5 мл. 0,25 % р-р на FеС12

дест. Н2О до марката на мерителната колба

Измерването на активността се извършва на Спекол 11 при А,= 500nm, а определянето на активността става по стандартна права N Е/мл. Работи се с кювети с които е построена стандартната права.

Приготвяне на стандарта.

Чист препарат на стрептомицин има 700 Е/мг. Изходният разтвор трябва да е с концентрация мг/мл. От него се правят разреждания. Пренасят се по 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10 мл. от изходния разтвор мерителни колбички от 25 мл. След това в тях се добавят по 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 и 1 мл дест. Вода, за да се доведе до 10 мл. във всяка колбичка.

В мерителните колбички се добавят още по 2 мл 1н NаОН и се поставят на кипяща водна баня в продължение на 10 мин. След това време се охлаждат на водна струя 3 мин. и се добавят 2 мл. 1,2 н НС1. Добавят се още 5 мл. 0,25% р-р на FеС12 и се допълва с дест. вода до марката на колбичката.

Успоредно се приготвя и контролна колбичка, в която се поставят отначало 10 мл. дест. вода и 2мл. 1н NаОН. След кипене на водна баня в продължение на 10 мин. се добавят и другите реактиви за стандартната колбичка.

Построяване на стандартната права. Определят се Ех (екстинциите) на оцветените разтвори с различна концентрация на стрептомицин и се нанасят на ординатната ос, а на абцисната ос се отбелязват активностите, изразени в Е/мл.

1.1.2.doc